300: Rise of an Empire bắt đầu bằng cái chết của vua Leonidas (Gerald Butler) và 298 chiến binh anh dũng xứ Sparta dưới đế giày binh đoàn Ba Tư tàn bạo của Thần Vương Xerxes (Rodrigo Santoro).

Nhận được hung tin từ người chiến binh duy nhất còn sống sót, hiền thê của Leonidas (Leana Headley) là Hoàng hậu Gorgo quyết tâm dồn binh tổng lực, tổng tấn công để trả thù cho chồng mình.

Đan xen vào đó còn là câu chuyện về cuộc chiến định mệnh giữa người hùng huyền thoại xứ Athens, Themistocles (Sullivan Stapleton) và Nữ tướng xứ Ba Tư xinh đẹp nhưng tàn nhẫn Artemisia (Eva Green).